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Nat Methods:陈玲玲/杨力/李劲松等开发新技术,实现环状 RNA 功能性筛选和研究

丁香学术

作者| Άτλας  来源|丁香学术(ID:dingxiangshiyan)

随着技术的发展,人类基因组中的所谓「垃圾」基因正在人们面前揭开面纱。

近年来,非编码 RNA 的相关研究备受关注,影响因子居高不下。其中环状RNA 是一大类非编码 RNA,年发文量也呈现逐年倍增的趋势(2017 年之后)。

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数据来源:PubMed

但是对很多研究组来讲,如何筛选具有功能的环状 RNA,如何开展进一步的功能研究,仍然相当困难!

近期,中科院多家机构合作,在这一领域取得重大突破,给人们带来了一项实用的技术。

环状 RNA 和 CRISPR-Cas 系统

环状 RNA(circRNA),是一类非编码 RNA,其 3' 和 5' 末端通过反向剪接形成共价连接。研究人员在真菌、植物、果蝇、小鼠以及人的细胞中均发现了多种 circRNA。

越来越多的实验研究表明,circRNA 并非 mRNA 剪接副产物,而是细胞中发挥重要作用的一类 RNA 分子。

circRNA 通常由编码基因的外显子部分反向剪接而来,但因缺乏区分 circRNA 与其同源外显子 mRNA 的方法,目前对特定 circRNA 的功能仍然知之甚少。

CRISPR-Cas 系统由具有核酸酶活性的效应蛋白复合物与效应蛋白结合的向导 RNA 组成,在细菌或古细菌体内发挥保护宿主抵抗病毒的作用。根据效应蛋白的组成成分和性质分为由多个蛋白成分组成效应蛋白复合物的 Class 1 和由单一蛋白质发挥效应作用的 Class 2 两大类。

Class 2 系统因组成成分简单而被广泛应用于哺乳动物细胞的基因敲除和敲入以及基因组标记,属于 Class 2 的 CRISPR-Cas13 系统,则是向导 RNA 介导的 RNA 靶向的内切酶系统。

目前 CRISPR-Cas13 共鉴定出四种亚型:VI-A (Cas13a/C2c2)、VI-B (Cas13b)、VI-C (Cas13c) 和 VI-D (Cas13d),用于 RNA 敲低、定点编辑、检测以及剪接调控等。

CRISPR 系统筛选功能性 circRNA

中国科学院上海营养与健康研究所(中科院 - 马普学会计算生物学伙伴研究所)研究员杨力与中科院分子细胞科学卓越创新中心研究员陈玲玲、研究员李劲松等团队合作,2020 年 12 月 7 日在国际学术期刊 Nature Methods 上,发表了题为 Screening for functional circular RNAs using the CRISPR-Cas13 system 的 circRNA 最新研究成果。

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 (图源:Nature Methods 官网)

CRISPR-Cas13 系统,能否通过 gRNA 靶向 circRNA 的反向剪接位点(BSJ)实现区分 circRNA 和其同源线性 mRNA 尚未可知。为回答上述问题,研究团队首先对 Cas13 家族蛋白(Cas13a,Cas13b,Cas13d)进行筛选,确定 circRNA 敲除的效果。

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 (图源:Nature Methods 官网)

分别验证了 LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、RfxCas13d 对 circPOLR2A、circPOLR2A 的敲低效果。

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 RfxCas13d 对 circRNA 的敲低效率最高(>80%)

(图源:Nature Methods 官网)

结果表明 RfxCas13d 对匹配的同源线性 mRNA 几乎无影响,提示 RfxCas13d-BSJ-gRNA 可较好区分 circRNA 和同源线性 mRNA。

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 (图源:Nature Methods 官网)

前述实验结果表明 RfxCas13d 是一种高效、特异的 circRNA 敲除工具。研究团队构建了靶向 9 个人类细胞系中 2908 个高表达 circRNA 的 BSJ-gRNAs 文库,尝试使用该工具鉴定潜在的参与细胞增殖的候选 circRNA。

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 BSJ-gRNA 文库构建

(图源:Nature Methods 官网)

研究团队将 BSJ-gRNA-RfxCas13d-HT29 细胞转移到裸鼠体内进行体内功能缺失(loss-of-function,LOF)表型筛筛选,注射 22 天后获得异种移植物。

满足 CDCscreen score≥2、有效 gRNAs≥2 且倍数变化≤0.5 条件的共有 79 个 circRNA,其中 8 个与 HT29、HeLa、293FT 及 H9 细胞系中进行功能缺失(loss-of-function,LOF)表型体外筛选结果重叠。CircFAM120A 是这些重叠的候选基因之一。

上述结果验证了 RfxCas13d/BSJ-gRNA 可用于人细胞系功能性 circRNA 筛选。

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CircFAM120A 的体内体外筛选

(图源:Nature Methods 官网)

为了深入了解 circFAM120A 在细胞增殖中的作用机制,研究团队通过 RfxCas13d-BSJ-gRNA 介导敲除 circFAM120A 和转录组分析等实验证实,CircFAM120A 通过阻止 FAM120A mRNA 与翻译抑制剂 IGF2BP2 结合,促进 FAM120A 表达,增强细胞增殖,发挥癌基因作用。

CircFAM120A 是一种常见的致癌 circRNA,通过上调亲本基因翻译来促进细胞生长

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(图源:Nature Methods 官网)

小鼠胚胎中存在大量的 circRNA,研究团队进一步探索了 RfxCas13d-BSJ-gRNA 系统是否同样适用于小鼠胚胎 circRNA。

 应用 RfxCas13d-BSJ-gRNA 筛选小鼠胚胎发育过程中具有潜在功能的 circRNA

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(图源:Nature Methods 官网)

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 (图源:Nature Methods 官网)

在小鼠胚胎中,BSJ-gRNAs 的 RfxCas13d 有效地靶向 circMan1a2 降解,与人细胞系中结果一致,RfxCas13d-BSJ-gRNA 筛选工具同样能够有效、稳定地干扰小鼠胚胎中的 circRNA 表达,而不影响对应的线性 mRNA。此外,研究人员还发现 circMan1a2 参与小鼠胚胎早期发育。

小结

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 (图源:中科院官网)

陈玲玲、杨力、李劲松研究团队基于 CRISPR-Cas 系统成功开发了 CRISPR–RfxCas13d, 后者可通过 gRNA 靶向 circRNA 反向剪接位点(BSJ)实现对 circRNA 和线性 mRNA 的区分。

基于该技术,研究团队成功构建了靶向人类高表达 circRNA 的反向剪接位点序列的慢病毒文库。通过筛选构建文库,研究团队发现了一组对细胞生长、胚胎发育等有重要作用的功能性 circRNA。

研究人员开发的这种基于 CRISPR-Cas13d 的筛选工具,能够在个体和大规模水平快速筛选和发现功能性 circRNA。

此外,RfxCas13d-BSJ-gRNA 工具可在不影响对应基因 mRNA 表达的情况下,构建 circRNA 功能丧失的小鼠模型,为探索 circRNA 功能奠定了基础。

延伸阅读

真核细胞 circRNA 来自于 mRNA 前体的反向剪接。虽然 circRNA 通常表达水平较低,但其表达存在细胞和组织特异性。因此,研究和探索生物特定 circRNA 的功能具有重要意义。

2016 年 2 月,陈玲玲研究团队在 Nature Reviews Molecular Cell Biology 杂志以题为 The biogenesis and emerging roles of circular RNAs 全面总结并探讨了 circRNA 的生物合成和新功能。

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 (图源:Nature Reviews Molecular Cell Biology 官网)

本文涉及的计算分析流程 CDCscreen 工具可在 https://github.com/YangLab/CDCscreen 进行学习和使用。

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(图源:Github 官网 YangLab 主页)

参考文献

1. Siqi Li, et al. Screening for functional circular RNAs using the CRISPR–Cas13 system. Nature Method, 2021, 18(1):51-59.

2. Chen LL. The biogenesis and emerging roles of circular RNAs. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2016, 17(4):205.

3. M. Piwecka et al., “Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function,” Science, doi:10.1126/science.aam8526, 2017.

题图来源:Science,第一次真正证明动物体内 circRNA 的功能[3]

编者按:本文转载自微信公众号:丁香学术(ID:dingxiangshiyan)


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