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Science:编辑蛋白质组!刘如谦利用噬菌体辅助进化,创造出新活性蛋白酶,可治疗多种疾病

生物世界

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作者|nagashi  来源|生物世界(ID:ibioworld)

肉毒杆菌素(Botulinum Toxin),也被简称为肉毒素,是由致命肉毒杆菌在繁殖过程中分泌的细菌外毒素,是一种蛋白酶,它是迄今为止人类发现的毒性最强的生物毒素,其毒性相当于等量氰化钾的1万倍,1毫克纯化结晶的肉毒杆菌素足以杀死2亿只小鼠!

虽然肉毒杆菌素看起来更像是一种生化武器,但基于其独特的神经毒性,肉毒杆菌素在人类世界中已然有了全新的应用。如今,肉毒杆菌素不仅是一种重要的医疗神经麻醉剂,还是一种风靡全球的美容药剂——肉毒杆菌素在消除皱纹方面具有显著的功效。此外,肉毒杆菌素还被用于治疗慢性偏头痛,肌肉痉挛等疾病。

当前以CRISPR为代表的基因编辑技术,通常用于研究治疗由基因突变引起的诸如镰状细胞病之类的慢性遗传疾病,CRISPR基因编辑通过修正错误的基因来达到治疗的目的。

但是,对于某些急性疾病,例如中风后的神经系统损伤,这并非由遗传错误引起。CRISPR基因编辑就难以发挥作用。而基于蛋白酶的疗法,可以通过对蛋白质治疗,帮助增强人体治愈神经损伤之类的能力。

数十年来,科学家一直渴望使用蛋白酶来治疗疾病,但目前蛋白酶并未广泛用于人类治疗药物,这其中的主要原因是目前还缺乏能产生可裂解指定蛋白质靶标的蛋白酶的技术。

近日,哈佛大学和麻省理工学院Broad研究所刘如谦(David Liu)团队、哈佛医学院董民团队合作,在 Science 杂志上发表题为:Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity 的研究论文。

这项研究通过噬菌体辅助持续进化技术(PACE)重新塑造了肉毒杆菌素,使其能够有效地切割特定的一种底物,而对其他底物没有活性,即增强了肉毒杆菌素的特异性。这就可以将肉毒杆菌素改造成治疗多种疾病的具有新活性的蛋白酶。

更重要的是,这种方法还能让酶蛋白产生前所未有的底物活性,产生具有量身定做的特异性的蛋白酶。这让“编辑蛋白质组成为可能,是对编辑基因组的发展和补充”。

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虽然生物分子也会自然进化,但整个进化过程极为漫长,最终的进化结果也无法控制。因此,几十年来,科学家一直使用实验室进化来生产具有特定功能的生物分子,但所要花费的时间仍然很久,而且还要求技术人员定期对样本进行操作。

对此,早在10年前,刘如谦及其同事就在 Nature 上发表了题为:A system for the continuous directed evolution of biomolecules 的论文,开发了一种生物分子进化的最新方法——噬菌体辅助持续进化(PACE)。

该方法将生物分子的实验室进化和噬菌体的生命周期结合在一起,让蛋白质在24小时内进化60轮。PACE的效率是传统实验室进化方法的100倍左右,整个实验过程也无需人为干预,大大节省了技术人员的劳动成本。

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在 Science 的这项研究中,刘如谦领导的研究团队开发了PACE正负选择系统,并用它来重新编程三种肉毒杆菌素轻链蛋白酶——BoNT/X、BoNT/F和BoNT/E,它们均具有多种天然底物特异性。

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PACE正负选择系统示意图

值得一提的是,肉毒杆菌素具有十分精致的结构设计,它包含三个结构域,且每个域都有不同的功能。其中,结合结构域将肉毒杆菌素引导到正确的细胞(神经元上的结合受体),易位结构域协助蛋白酶结构域穿过细胞膜进入细胞,而轻链蛋白酶结构域则是肉毒杆菌素的活性区域,它在神经元内切割不同的可溶性NSF附着蛋白受体(SNARE)。

具体而言,蛋白酶结构域通过广泛的相互作用和几个外部位点(肉毒杆菌素上的次级底物结合位点)识别底物,以此表现出高底物特异性。而SNARE蛋白在膜泡融合中起关键作用,其功能丧失将切断神经与肌肉之间的信号交流。

对此,研究团队将BoNT/X进化成能够优先切割泡囊相关膜蛋白4(VAMP4)和Ykt6的不同变体;将BoNT/F蛋白酶进化成选择性切割非原生底物蛋白VAMP7;并将BoNT/E蛋白酶进化成切割PTEN蛋白,但不能切割神经元中的任何天然BoNT蛋白酶底物。

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PACE正负选择系统在定向改造进化BoNT/X LC蛋白酶中的应用

此外,进化后的肉毒杆菌素轻链蛋白酶在特异性上显示出很大的变化——218到超过11000000倍的变化,并且可以保留它们形成全毒素的能力,这些毒素可以自我传递到神经元上。

文章的第一作者 Travis R. Blum 表示:“这些发现建立了一个多功能的平台,可以重新编程蛋白酶,并选择性地切割新的治疗靶点。”

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进化后的BoNT蛋白酶在结构、活性和全毒素相容性上存在差异

总而言之,这项研究不仅表现了噬菌体辅助持续进化技术(PACE)在生物分子人工快速进化上的强大优势,还证实了一个重要观点——人类可以定制蛋白酶的底物特异性使其具有新的功能!

如今,刘如谦团队开发的技术可以用于改善和改变蛋白酶的特异性,未来或将应用于医疗、生物学研究、整形美容乃至人类生活的方方面面!

DNA是生命信息的携带者,而蛋白质是生命活动的执行者。作为单碱基编辑技术的奠基人,刘如谦在噬菌体辅助进化领域同样取得了一系列重要突破。

当人类可以按意愿修改遗传基因,还可以定向改造出特定的生物蛋白质时,人类就可以在很大程度上主宰自身的命运,成为自己的“神”,而科学技术的进步会不断将这一“神话故事”复现为现实!

论文链接:

https://science.sciencemag.org/content/371/6531/803.full

https://www.nature.com/articles/nature09929

编者按:本文转载自微信公众号:生物世界(ID:ibioworld),作者:nagisha


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